鈣通量測定是用于篩選G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）的藥物發(fā)現(xiàn)中的優(yōu)選方法。 我們的Quest Fluo-8系列鈣檢測試劑是最亮的綠色鈣指示劑。 

1.使用鈣指示劑AM Esters加載細(xì)胞：

        AM酯是非極性酯，其易于穿過活細(xì)胞膜，并且通過活細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞酯酶快速水解。 AM酯廣泛用于非侵入性地將各種極性熒光探針裝載到活細(xì)胞中。 但是，使用AM酯時必須小心，因?yàn)樗鼈円子谒?，特別是在溶液中。 它們應(yīng)在使用前用高質(zhì)量的無水二甲基亞砜（DMSO）重新配制。 DMSO儲備溶液應(yīng)在-20°C下干燥儲存并避光。 在這些條件下，AM酯應(yīng)穩(wěn)定數(shù)月。

        以下是我們推薦的將AM酯加載到活細(xì)胞中的方案。該方案僅提供指南，實(shí)際情況應(yīng)根據(jù)您的具體需求進(jìn)行修改。

a）在高質(zhì)量無水DMSO中制備2至5 mM AM酯原液。

b）在實(shí)驗(yàn)當(dāng)天，將鈣指示劑溶解在DMSO中或?qū)⒌确莸闹甘緞﹥淙芤航鈨鲋潦覝?。使?.02％Pluronic?F-127在您選擇的緩沖液（如Hanks和Hepes緩沖液）中制備1至10μM的工作溶液。對于大多數(shù)細(xì)胞系，我們建議鈣指示劑的最終濃度為4-5 uM。 細(xì)胞加載所需指標(biāo)的確切濃度必須根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定。 為避免因過載和潛在染料毒性引起的任何偽影，建議使用可產(chǎn)生足夠信號強(qiáng)度的最小探針濃度。

注意：非離子洗滌劑Pluronic?F-127有時用于增加鈣指示劑AM酯的水溶性。

c）如果您的細(xì)胞含有有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，可以在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入丙磺舒（1-2.5 mM）或磺吡酮（0.1-0.25 mM），以減少脫酯化指標(biāo)的泄漏。 在室溫或37°C下用鈣指示劑酯孵育細(xì)胞20分鐘至1小時。

d）在HHBS或您選擇的緩沖液（含有陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑，如2.5mM丙磺舒，如果適用）中洗滌細(xì)胞1-2次以除去過量的探針。

e）在所需的Ex / Em波長下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)